NY∕T 3166-2017 家蚕质型多角体病毒检测实时荧光定量PCR法(农业)
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ID： |
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文件大小(MB)： |
0.34 |
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页数： |
8 |
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日期： |
2021-12-27 |
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ICS 07.080,B 47 NY,中华人民共和国农业行业标准,NY/T 3166一2017,家蚕质型多角体病毒检测,实时荧光定量PCR法,Detection of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus-Real time PCR method,2017 -12-22 发布2018-06-01 实施,中华人民共和国农业部发布,前言,本标准按照GB/ T 1. 1-2009 给出的规则起草,本标准由农业部种植业管理司提出,本标准由全国桑蚕业标准化技术委员会归口(SAC/ TC 43 7) ,NY/T 3166-2017,本标准起草单位:江苏科技大学、中国农业科学院蚕业研究所、农业部蚕桑产业产品质量监督检验,测试中心(镇江)、苏州大学、西南大学、华南农业大学,本标准主要起草人:吴萍、郭锡杰、陈涛、贡成良、潘敏慧、李龙、孙京臣,I,NY/T 3166-2017,家蚕质型多角体病毒检测实时荧光定量PCR 法,1 范围,本标准规定了家蚕质型多角体病毒CBombyx mori cytoplasrnic polyhedrosis virus) 的实时荧光定,量PCR 检测方法,本标准适用于家蚕中肠组织中,2 规范性引用文件,3 缩略语,4 原理,5 试剂与设备,5. 1 试剂与耗材,除另有规定外，所用生,用超纯水。提取RNA 所用试剂,酶污染,5.1 . 1 RNA 提取试剂,5. 1. 2 一氯甲烧,5. 1. 3 异丙醇,5. 1. 4 75 % 乙醇,5. 1. 5 DEPC ,5.1 . 6 cDNA 合成试剂盒,5. 1.7 荧光定量PCR 试剂盒,日期的版本适用于本文,脱氧核糖核,6682 一级水要求并经灭菌或采,配制，分装的容器应无RNA,1,NY/T 3166-2017,5. 1.8 无RNA 酶污染的枪头和离心管,5.2 主要仪器设备,5.2. 1 实时荧光定量PCR 仪,5. 2.2 紫外分光光度计,5. 2. 3 高速冷冻离心机,5.2.4 -20 0C 冰箱和-80 0C 冰箱,5. 2. 5 组织研磨器或研钵,5. 2. 6 微量加样器,6 样晶的采集,采集家蚕中肠组织(0 . 1 g~O. 5 g) 后迅速放人液氮中，再转移至一80 0C 冰箱保存,7 操作方法,7. 1 RNA 的提取,7. 1. 1 将样品放人预冷的研钵中加人液氮，用研样将待检样品磨成粉末状(保持液氮不挥发干净) ，分,装到元RNA 酶的1. 5mL 离心管中，每0 . 1 g 组织加1. OmL RNA 提取试剂，样品体积应小于Trizol 体,积的10% ，振荡混匀，室温(200C~300C) 温育10 min , 12 000 g ， 4 0C 离心10 min ,7. 1.2 将上清液转移到新的1. 5mL 离心管中，每1 mL上清液中加人0 . 2mL 三氯甲:皖0 / 5 体积) ，剧,烈摇动15 s ，室温放置5 min, 12 000 g ， 4 0C离心15 min; 混合物分层，卧-l"A 位于上层水相,7. 1.3 将上清液小心转移到新的1. 5 mL 离心管中，加人等体积预冷的异丙醇(可在一20 0C 冰箱放置,20 rnin 以上) ，颠倒混匀10 次，室温静置10 min, 12 000 g ， 4 0C 离心10 min ，弃上清液，保留RNA 沉淀,7. 1 . 4 加入75 %乙醇(DEPC 7l<配制)，1. 0 mL RNA 提取试剂加人1. 0 mL 75 % 乙醇，轻轻混匀,7500 g ， 4 0C 离心5 min ，弃上清液,7. 1.5 将RNA 沉淀置于室温下自然风干5 min~ 10 min ，用30μL~40μL 的元RNA 酶超纯水常温溶,解RNA ,7. 1.6 利用紫外分光光度计测定RNA 溶液的光密度值。当A260 / A280 值为1. 90~2 . 05 时，提取的,RNA 质量符合PCR 的检测要求。剩余RNA 置于一80 0C 冰箱保存备用,7.2 cDNA 的合成,以7. 1 中提取的RNA 为模板，按照市售商品化试剂盒说明书反转录合成cDNA 。以Takara 公司,生产的，货号为DRR047A 试剂盒1)为例: 首先进行去除基因组DNA 反应，反应体系10μL(反应液A) ,其中， 5X gDNA Eraser Buffer 2μL， gDNA Eraser 1μL ， RNA 500 吨，补加元RNA 酶超纯水至10μL,终体积。42 0C反应2 min 。然后进行反转录反应，反应体系20μL ，其中， 5 X Primer Script. Buffer 4,μL 、Primer Script. RT Enzyrne Mix 1 1μL 、RT Primer Mix 1μL 、反应液A 10μL ，补加元RNA 酶超,纯水至20μL 终体积。反应条件:3 7"C 15 min, 85,0,C 5 s 。反转录合成的cDNA 置于一20 0C 冰箱备用,7.3 实时荧光定量PCR 检测,7. 3. 1 引物序列,2,正向引物:5'一ATACAAGGTTGGCATTTCAGA - 3';,反向引物:5' - ACCGCCGTTAGGATAGTAGAT - 3' 0,荧光定量PCR 产物信息参见附录A ,1) 该试剂盒是适合的市售产品的实例。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可,NY/T 3166-2017,7. 3.2 对照设置,阳性对照:含……
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